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一文带你了解干细胞培养全流程

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-10-16T00:00 (访问量:26883)

 

干细胞(Stem cells)是未分化的或部分分化的细胞,具有自我更新和多次分化的能力。在一定条件下,可分化成多种功能细胞。未充分分化的干细胞因具有再生各类组织器官和人体的潜在功能,被称为“万用细胞”。常见干细胞培养有造血干细胞(HSC),胚胎干细胞(ESC),神经干细胞(NSC),多功能干细胞(iPSC),间充质干细胞(MSC)等干细胞培养。由于干细胞具有再生组织和修复的潜力,来替换身体里受损或生病的细胞,因此在自身免疫性疾病、神经系统性疾病、心血管类疾病、骨骼系统疾病、眼科类疾病以及代谢性类疾病等领域有着广泛的应用前景。

 

2006年,山中伸弥等科学家把4个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞,使其变成多功能干细胞(iPSC),意味着体细胞能够被改造发展成所有类型细胞,开启了干细胞研究的新纪元,于2012年因该项成果发现荣获诺贝尔生理学或医学奖。以“stem cell”作为关键词,在clinicaltrials.gov网站中检索到,截至2024年8月31日全球干细胞临床试验有7253项,其中早期阶段(145)、临床I期(2,448)、II期(3,291)、III期(671)、IV期(166)。目前,国内已批准成立干细胞临床研究备案机构近150余家,通过审批备案的干细胞临床研究已达140余项。干细胞研究已成为重要的方向,接下来小翌将带你了解干细胞的整个培养流程,避免踩坑。

 

 

 

 

 

复 苏

 01 稀释前将Ceturegel®基质胶和适量体积的DMEM/F12放入4度冰箱过夜融化。

02 将融化的Ceturegel®基质胶和DMEM/F12从冰箱取出并打开盖子,10ml移液管吸吹DMEM/F12几次以冷却移液管,并吸取适量DMEM/F12加入装有Ceturegel®基质胶的容器中混匀,4度保存,1个月内使用,-20或-80度可保存半年以上。

03 吸取适量稀释的Ceturegel®基质胶(货号40190,稀释比例按1:80~1:160,浓度约为10mg/ml为基准)置于6孔板中,轻轻摇晃,使Ceturegel®基质胶均匀平铺于孔板底部,培养箱放置1h以上,种细胞前弃掉,之后每次传代也要先培养器皿内铺胶包被。

04 将H9(人胚胎干细胞)细胞冻存管从液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染。

05 将冻存管内细胞悬液转移至含3~4ml的H9完全培养液的15ml离心管内,以1000rpm,离心5min。

06 离心后将上清液吸除,轻弹离心管底,使细胞沉淀松散,加入新鲜的H9完全培养液2~3ml,轻轻吹打一次使细胞克隆块悬浮。

07 转移至已经铺好Ceturegel®基质胶的6孔板中培养。

08 复苏第二天不换液,第三天起每天更换H9细胞完全培养液。

 

注意:复苏时不能吹打过度,不能吹打成单细胞,保持细胞克隆块状,复苏后48小时换液,期间最好不要挪动细胞。H9复苏后可能4~5天才开始有克隆出现,7-10天传代(具体视克隆密度和大小而定)。

 

 

 

传 代

  01 一般在复苏后第7~10天传代,之后常规传代为6-7天一次。

02 吸除废液。用DPBS(不含钙镁离子)轻轻冲洗一遍。03 加入2~3ml的1mg/ml的干细胞专用消化液至培养瓶,轻轻晃动,使之覆盖底面,置于37℃培养箱内消化细胞。

04 在显微镜下观察,直至克隆脱落(一般需要3~6min)。

05 将带有脱落克隆的消化液转移至15ml离心管中,放置一会,待克隆自然沉降后将上层吸除,加入H9完全培养液3ml轻轻混匀,放置一会,待克隆自然沉降后将上层培养液吸除,重复一次(即H9完全培养液漂洗2遍,沉降后吸掉上清)。

06 加入H9完全培养液3ml,用1ml移液器吹打2-3次,将克隆块吹散成大小为原来的约1/10(若想得到大小较均一的克隆块,此时可将细胞静置片刻,待细胞自然沉降后取悬浮于液体中间层的克隆块传代),传代比例根据母瓶克隆密度和大小而定,一般1:3~1:5传代。

07 放入37℃培养箱内培养。

08 第二天不换液,第三天起每天换液,换液前显微镜下将分化的克隆挑除。

 

注意:传代时不能吹打过度,不能吹打成单细胞,保持细胞克隆块状,传代后48小时换液,期间最好不要挪动细胞。每6~7天传代一次。

 

 

 

冻 存

  01 按传代的方法将细胞消化下来,漂洗后细胞沉于离心管底部(上述传代中步骤5)。

02 冷冻比例根据母瓶克隆密度和大小而定,一般1个T25培养瓶可冷冻1-3个冻存管。向离心管内加入1/2冷冻体积的H9完全培养液,轻轻混匀。

03 逐滴加入已经预冷(4℃)的细胞冻存液,一边加一边轻轻晃动离心管。

04 1ml移液器轻轻混匀细胞(保持克隆块,不可吹打过度),每支冻存管内加入500ul~lml细胞悬液,标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。

05 将冻存管置于程序降温盒内,-80℃过夜,转入液氮。

 

 

实验相关产品

 

产品名称

货号

规格

Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶

40190ES08/10

5/10 mL

NSC-27 supplement, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂

60703ES

10 mL

NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂,去除维生素A

60704ES

10 mL

NSC-27 supplement without Antioxidant, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂,无抗氧化剂

60705ES

10 mL

NSC-27 supplement, serum free, 50X(animal origin-free)无血清 NSC-27 添加剂(非动物源)

60711ES

10 mL

NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X(animal origin-free) 无血清 NSC-27 添加剂,去除维生素A(非动物源)

60712ES

10 mL

N-2 supplement,serum free,100X N-2无血清添加剂,100×

60706ES

5 mL

N-2 supplement,serum free,100X N-2无血清添加剂,100X(非动物源)

60713ES

5 mL

DMEM/F-12 Reduced Serum Medium DMEM/F-12减血清培养基

41420ES76

500 mL

 

参考文献:

【1】HoangDM , PhamPT , BachTQ , NgoATL , NguyenQT .  Stemcellbasedtherapyforhumandiseases . SignalTransductTargetTher . 2022Aug6 ; 7 (1) : 272 .doi : 10.1038 / s41392- 022- 01134- 4 . PMID : 35933430 ; PMCID : PMC9357075.

 

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