腺瘤到癌的发展是一个被广泛接受的散发性结直肠癌的发展路线。然而，异常上皮细胞的细胞异质性限制了我们对结直肠组织癌变的理解。本研究对来自患者匹配的组织样本的54,788个细胞进行了单细胞RNA测序调查，包括血液、正常组织、癌旁、息肉和结肠直肠癌。在癌变的每个阶段，描述了不同细胞群的细胞类型、转录特征和差异表达基因。上皮细胞在正常、良性和恶性阶段的分子特征。腺瘤和癌的前体细胞群被鉴定和特征化，然后通过大队列活检进行验证。

单细胞测序

1.结直肠正常组织、腺瘤和癌组织的单细胞转录组分析

为了动态地分析正常腺瘤-癌序列中每种细胞类型的进化和分子特征，使用scRNA-seq技术对每个细胞群的转录组进行了分析（图1a）。我们同时采集了同一例接受根治性手术的患者的血液、正常、癌旁、息肉和癌组织样本（图1b）。从4例未经治疗的CRC患者中收集了12例组织样本。通过H&E染色证实了其病理情况（即腺瘤和癌）（补充图1a)。通过体细胞变异分析，在患者匹配的腺瘤和癌中观察到多个突变（图1c）。这种遗传相似性高度暗示了正常组织、腺瘤和癌之间的遗传谱系相关性。克隆发育分析，确定了细胞群的动态变化（图1d），进一步证实了其进化关系。这些质量检查表明，从患者匹配的连续病变的活检再现了结直肠肿瘤发生的病理进展。

基于聚类、组织来源和患者来源的t-SNE图来可视化细胞群（图2a，b）。基于几个已知细胞系的典型标记基因，确定集群注释细胞类型：肠细胞（GUCA2A）、杯状（MUC2），肠内分泌（CHGA）、腺瘤（腺瘤上皮细胞）、上皮细胞（上皮细胞）、CD8+ T（CD8A）、滤泡辅助T（CXCR5）、中央记忆T（IL7R）、调节性T（FOXP3）、自然杀伤T（KLRD1）、滤泡B（MS4A1）、血浆B（MZB1）、M1巨噬细胞（IL1B）、M2巨噬细胞（CD163）、单核细胞（CD14）、成纤维细胞（COL1A1）、内皮细胞（VWF）和肥大细胞（KIT）（图2c和补充图2a、b）。采用了两种独立的方法来排除批处理效应的影响。我们在t-SNE图上观察到，来自这三个患者的肠上皮细胞和杯状细胞分别合并在一起，突出了一种上皮亚型特异性的方式（补充图3d）。因此，所有这些结果都保证了scRNA-seq数据满足质量的要求，这适合于进一步的数据挖掘。尽管存在个体差异，但在所有组织和患者中均观察到大多数细胞群（图2d和补充图3g）。来自不同患者的正常上皮细胞聚集在一起，这意味着它们具有相似的表达特征。相比之下，来自不同患者的异常上皮细胞（腺瘤或癌）分别聚集在一起，表现出高度异质性的特征，表明致癌的分子机制多样化（图2e）。

2. 结直肠癌发生进化过程中的三个上皮细胞阶段

为了更好地了解结直肠癌的发生，重点研究了正常、腺瘤和癌组织中的上皮细胞。考虑到个体差异，我们分别招募了来自同一患者的上皮细胞来探索上皮细胞的进化。来自P1和P2的上皮细胞，如图2a所示。根据恶性程度进行分类，并使用t-SNE重新绘制分析（图3a和补充图6a)。由于上皮细胞数量不足，我们将患者3排除在本分析之外（补充图3g）。正常、腺瘤和癌组织的细胞明显分离（图3b和补充图6b）。然后，我们根据上皮细胞的病理遗传标记物将上皮细胞分为生理细胞、良性细胞、恶性细胞和其他群体（图3c和补充图6c）。非临床结直肠上皮标记基因，包括肠上皮细胞（GUCA2A、SLC26A3和CA1）、杯状细胞（MUC2和TFF3）、肠内分泌细胞（CHGA）和干细胞（LGR5）。细胞计数结果显示，生理细胞、良性细胞和恶性细胞分别主要来自正常组织、腺瘤组织和癌组织（图3d和补充图6d）。将具有代表性的DEGs分为三组（1、2、3），与典型标记物一致，对应生理、良性和恶性分期（图3e）。这些在CRC期间的deg的连续上调发展强调了一种时间机制，驱动从正常到良性到恶性的结直肠组织。值得注意的是，良性和恶性人群中都包含一组上调的基因（第2b组：PCCA、LEFTY1、DPEP1、ASCL2、SIVA1、MYC和OLFM4），这意味着良性人群中处于恶性中间阶段。这些标记基因也为我们提供了一个研究阶段过渡事件的模型（见图4）。这些基因在P2上皮细胞中也观察到类似的表达模式（补充图6e）。然后，通过将基因表达数据投影到t-SNE图中（图3f和补充图6f），确认了它们在组织中的分布。基因集合变异分析（GSVA）解读了三种细胞类型的生理和病理信号（图3g和补充图6g）。营养吸收和代谢的特征在正常细胞群中得到丰富，并与肠上皮细胞的生理功能相一致。

对DEGs的分析将这些混合群体与正常、良性和恶性的上皮细胞区分开来（图3c和补充图6c）。然后，我们使用富集分析来描述具有异质性组织来源的细胞群的转录组特征。正常腺瘤的混合群体（P1和P2的Cluster9）与生理和良性群体的其余群体相比表现出强烈的增殖特征（图4a和补充图9a）。它们也没有干细胞性特征或基底细胞特征（图4b），排除了正常干细胞的来源。因此，这两个簇可能是正常和腺瘤细胞之间中间阶段的腺瘤前体细胞群。前体细胞群位于从生理阶段到良性阶段的假时间轨迹路线图的中间位置（图4c和补充图9b）。接下来，我们确定了特定的标记基因来定义腺瘤前体细胞群。DEGs分析显示，这些群体中特异性上调的基因包括HPGDS、SH2D6、HCK和BMX（图4d和补充图9d）。然后，我们通过检测在癌变过程中起关键作用的标记蛋白BMX和SH2D6来评估活检切片中前体群体的复发情况（图4e）。20例患者中有9例和14例分别为腺瘤前体细胞群中BMX和SH2D6水平较高的细胞群（补充表3）。出乎意料的是，腺瘤前体细胞群P1和P2在deg中有约30%的重叠（图4f）.

参考文献：

[1]Single-cell transcriptomic profiling unravels the adenoma-initiation role of protein tyrosine kinases during colorectal tumorigenesis[J].Signal Transduction and Targeted Therapy[2024-04-29].DOI:10.1038/s41392-022-00881-8.