Super enhancer，SE，即超级增强子，是一类具有超强转录激活特性的DNA顺式调控元件，它们共同控制涉及细胞身份的关键基因网络，并与众多疾病的发生密切相关，是当前科研领域的又一蓝海，之前吉凯的科研大咖已经分享过SE涉及的研究领域以及热点方向<<研究不够“高大上”？想冲刺高分文章？一起来看看 Super enhancer吧!>>，今天我们谈谈另一个话题，如何进行下游实验设计？
在Richard A. Young于2013年提出SE概念之前，大部分学者研究基因的转录调控元件多局限于转录起始位点附近，这些调控序列一般较短且挨着启动子，因此可以直接采用荧光素酶报告系统，构建 “增强子+启动子”的全序列研究对应增强子的功能。但SE是一类在基因组上跨度较大（长约几K至上百K），且远离其调控的基因，很多老师依然想采取传统的“增强子+启动子”的方式验证，显然是不合理的，
原因在二，第一：SE跨度较大，超出构建质粒的范畴；第二：人为将SE与启动子拉近构建（在基因组不挨着，但是构建的时候人为拼接在一起），并不能说明隔空的SE会对远端的启动子有调控作用。
因此，小编就盘点主要的获得ChIP数据之后的SE功能如何验证！！
（一）金标准：SE缺失
//适用场景：SE跨度大；不明确SE含有的转录因子调节网络
要确认SE是否调控远端基因，最理想的情况为将SE缺失，直接验证基因的表达水平。Sox2是维持胚胎干细胞 (ESC) 的多能性的主转录因子之一，Bing1等人通过H3K27ac ChIP-seq 数据，发现位于 Sox2 基因座下游约 100kb，有一个跨越长度约为13kb的区域，有潜在的SE功能：
作者认为，报告基因检测证实该序列可以作为外源性增强子发挥作用，但并未证明远端靶基因是否可以在体内被增强子激活。敲除增强子序列是金标准方法，因此，针对该SE两侧各设计了一个CRISPR的cas9靶点，将其切割，并通过PCR以及QPCR验证了一部分细胞实验了SE的缺失：
由于缺失了SE，Sox2表达水平下降明显，且正如预期的那样，由于 Sox2 和其他几种多能性因子的表达降低，Sox2-SE远端缺失影响了mESC 培养物的增殖和形态
（二）SE关键位点抑制/激活
// 适用场景：已明确核心位点（已知感兴趣的位点或者SNP）
若SE跨度短，有明确的研究位点，或者由于突变等因素引发的SE功能异常，则可以通过重塑局部表观遗传达到研究目的。Xu2等人将 dCas9 与赖氨酸特异性去甲基化酶 LSD1（或 KDM1A）融合，后者催化去除增强子相关的 H3-Lys4 单甲基化和二甲基化（H3K4me1/2），及 MS2-sgRNA 以招募 MCP-KRAB 抑制域，这套系统称为enCRISPRi（是dCas9-KRAB的改进型）。将 enCRISPRi 靶向高表达β-珠蛋白基因的 K562 红白血病细胞中的 HS2 增强子，与对照sgGal4相比，四种独立的 sgRNA（sgHS2-1 到 sgHS2-4）实现了对 β-珠蛋白基因（HBE1、HBG1/2和HBB）的3.4至 13.7 倍抑制
作者进一步在动物水平以enCRISPRi建模，在 T 细胞急性淋巴细胞白血病 (T-ALL) 细胞系和患者中TAL1原癌基因上游 8 kb 增强子发生突变，杂合体细胞突变通过在TAL1增强子序列处插入可变数量的核苷酸获得，于是客户设计了突变型特异性靶点（sgMut1 和 sgMut2），对照sgGal4，以及插入序列附近野生型靶点（sgWT1和sgWT2）。结果表明enCRISPRi有效介导了TAL1 蛋白的表达，损害了体外 T-ALL 的生长（对应f，g，h）：
同时，作者还构建了激活增强子的系统enCRISPRa，同样取得了在动物模型通过激活增强子实现基因上调以及疾病模型的体现（对应c，d，i）。
（三）荧光素酶报告系统
//适用场景：寻找SE的关键调控区/位点
作为传统研究基因调控网络的“双荧光素酶报告系统”，在SE的研究中，虽然无法说明远端调控的影响，但依然有其用武之地。Michelle等人在研究EBV病毒如何调节B细胞生长时，发现EBV 编码的 EBNA2 转录因子通过距离RUNX3约-97 kb 超级增强子内的特定元件激活RUNX3，该增强子区域内预测出六个EBNA2的结合位点，为了进一步寻找出主调控区域，作者构建了每个结合位点的截断体（E表示）与RUNX3启动子-737 到 +44一同构建至pGL3 basic，通过荧光素酶报告系统发现：
当含有所有增强子区域时，激活高达 8.4 倍，EBNA2 能够通过E2 激活高达 3.8 倍的转录， E4 和 E6 被 EBNA2 激活高达 2 倍，因此说明了EBNA2主要通过E2、E4、E6三个位点调节表达，且E2 是 EBNA2 激活的关键位点。
随着测序技术的发展，相信越来越多的基因组未知功能会被发现。SE作为一个科研方向，正发展壮大，为基因调控网络又添加了一员大将，且有望成为新的药物靶标。吉凯基因紧跟科研热点，提供众多工具类的产品，对超级增强子感兴趣的老师们，快来咨询吧！！！
病毒实验帮
公众号底部菜单栏【新功能】上线！
免费在线学习《国自然热点研究》、《数据库及软件操作教程》
一键下载《病毒使用手册》、《高分文献》
还有不定时的送新书、抽奖活动，赶紧来扫码关注一波吧