绝对定量与相对定量概述
当对实时荧光定量 PCR (qPCR) 的结果进行计算时，可以采用绝对或相对定量。
| 绝对定量 （数字 PCR 法） |
绝对定量（标准曲线法） | 相对定量 | |
|---|---|---|---|
| 概述 | 使用数字 PCR 进行绝对定量时，无需已知的标准品。能够以数字 PCR 重复数确定的精确度对目标分子直接进行定量。 | 使用标准曲线法进行绝对定量时，可以基于已知数量对未知数量进行定量。首先创建标准曲线；然后比较未知数量与标准曲线并推断出数值。 | 在相对定量中，您可以分析特定样品相对于参考样品（比如，未处理的对照样品）某个基因表达量的变化。 |
| 示例 |
确定异质混合物中存在的稀有等位基因拷贝数。 以基因组 DNA 为靶标，统计样品中的细胞等价物的数量。 确定指定样品中存在的病毒拷贝的绝对数量，而无需参考标准品。 |
将病毒拷贝数与疾病状态建立关联。 |
测量基因表达对药物的应答。 在此示例中，您可以比较经化学处理样品中的特定目标基因的基因表达水平与未处理样品中的基因表达水平。 |
使用数字 PCR 法进行绝对定量
数字 PCR 的工作原理在于将样品分割到许多单独的实时荧光定量 PCR 反应中；这些反应部分包含了目标分子（阳性），而其他不包含（阴性）。PCR 分析后，一部分阴性结果用于生成样品中目标分子精确数量的绝对结果，而无需参考标准品或内源性对照品。
图 1： 数字 PCR 使用阳性（白色）与阴性（黑色）PCR 反应的比例来计算目标分子的数量。
使用标准曲线法进行绝对定量
用于绝对定量的标准曲线法与用于相对定量的标准曲线法类似，只是标准品的绝对量必须首先通过其他独立方法获取。
图 2： 用于绝对定量的扩增图和标准曲线
关键指南
下面的指南对于绝对定量中标准曲线的正确使用十分关键：
- 来自单一、纯净物种的DNA或RNA是十分重要的。例如，从大肠杆菌制备的质粒DNA通常都会存在RNA的污染，这会增加A260的读数而增加质粒的拷贝数计算结果。
- 准确的移液是必需的因为标准品需要经过不同的数量级的顺序稀释。质粒DNA或体外转录的RNA必须被浓缩以便获取准确的A260测量值。浓缩的DNA或RNA随后必须被稀释106–1012倍以获得与生物学样品中目标分子相似的浓度。
- 稀释的标准品的稳定性也需要引起注意，特别是对于 RNA。将稀释的标准品分装至多份，储存在 –80 °C 条件下，并仅在使用前才进行解冻。
一般无法使用 DNA 作为 RNA 绝对定量的标准品，因为对于逆转录过程的效率没有对照。
标准品
标准品的绝对量必须首先通过其他独立的方法获取。质粒 DNA 和体外转录的 RNA 通常用于制备绝对标准品。浓度可在 A260 处测量得到，并通过使用 DNA 或 RNA 的分子量转化成拷贝数。
相对定量
相对定量的计算方法
相对定量可根据从所有实时荧光定量 PCR 仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：
- 标准曲线法
- 比较 CT 法
图3： 相对定量
|
概述
|
||
| 数字 PCR 法 | 标准曲线法 | 比较 CT 法 |
|---|---|---|
| 核酸定量采用很多技术复制 PCR 应用中广泛使用的限制样品稀释原理。 根据阴性反应数与总反应数的比率可确定绝对定量。此分析类型与 Ct 和 ΔCt 比较不同，相反，它允许对每个检测靶标单独定量，无需参考标准品。 | 因采用的是相对于基础样品（称为校准品）的表达量，例如未经处理的对照品，因此用于相对定量的标准曲线容易绘制。 对于所有的实验样品，您可以从标准曲线确定靶标量，然后除以校准品的靶标量。 因此，校准品便成为 1× 样品，而所有其他的量则都为以 n 倍校准品来表示。 |
此方法可在单个样品中比较一个靶基因与另一个靶基因的 Ct 值（使用公式：2ΔΔCT）——例如，一个内部对照基因或参考基因（例如管家基因）。 |
|
产品优势 |
||
| 无需依赖参考物或标准品。
通过增加 PCR 平行样的总数可实现所需的精度。 高度耐受抑制剂。 能够分析复杂混合物。 与传统 qPCR 不同，数字 PCR 对出现的拷贝数呈线性反应，可以检测到较小倍数变化的差异 |
在不同的反应管中进行目标分子和内源性对照的扩增时，采用标准曲线法进行分析，所需优化和验证操作最少。 | 您无需标准曲线并且可以提高通量，因为标准曲线样品不再需要孔。这样就可以消除创建标准曲线样品时出现的稀释错误。
您可以在同一管内对靶标和内源性对照品进行扩增，可提高通量并减少移液错误。 当 RNA 位于模板中时，在同一管内执行扩增可针对 RNA 完整性和逆转录效率等变量进行部分归一化。 |
实验验证 |
||
| 与已知拷贝数且表征良好的样品进行并行比较，对数字 PCR 的结果进行验证。 | 参见上文的优点。 |
您必须运行验证实验，以表明靶标和内源性对照品扩增的效率大致相同。 |
关键指南 |
||
| 在整个实验设置过程中，请务必尽量使用低吸附性塑料器具。由于数字 PCR 强调有限稀释检测法，粘附至中等配置设备的任何样品将会丢失并使结果偏离。我们建议使用 2.0 mL 低吸附管进行稀释并使用低吸附移液器吸头。 请务必了解需要检测的样品的数字区域。如果不清楚，请查阅用户指南，确定已知物种 (gDNA) 的拷贝数，或者使用多次稀释的样品/检测试剂盒组合执行初步筛查实验，以确定能够确保获得有意义数据的最佳数字浓度。 样品不应长时间储存在低浓度条件下，也不应进行过多次冻融操作。尚未证明载体对于可重复性的重要性与使用非粘附塑料器具进行试验设置相同。请认真制定稀释计划，以尽量减小稀释方案造成的变异性。 |
RNA或DNA储存液的准确稀释是十分重要的，但用于表达稀释的单位是无关的。如果对来自对照细胞系的总RNA进行了2倍的稀释后进行标准曲线的绘制，则单位应该是稀释值1、0.5、0.25、0.125等。如果使用相同的 RNA 或 DNA 储存液进行不同板上的标准曲线绘制，则可在不同板之间比较确定的相对定量。 您可以使用 DNA 标准曲线进行 RNA 的相对定量。这么做需要假设靶标在所有样品中的逆转录效率都是相同的，但并不需要知道效率的精确值。 在采用内源性对照进行定量均一化时，应该对目标分子和内源性参考都进行标准曲线的绘制。对于每一个实验样品，目标分子和内源性对照的量都是根据合适的标准曲线而确定的。因此，目标分子的量除以内源性对照的量便是均一化后的目标分子值。同样的，其中的一个实验样品便是校准品，或 1× 样品。每一个均一化的目标分子值除以校准品的均一化值后便是相对的表达水平。 |
为了有效地利用比较 CT 法，目标分子（基因）和对照（内源性对照）的扩增效率应当近似相同。 |
内源性对照 |
||
| 数字 PCR 不依赖内源性对照品进行参考测量。 | 对于内源性对照进行扩增可用于对加入至反应的样品 RNA 或 DNA 的量进行标准化。对于基因表达定量，研究者采用过 ß-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)、核糖体 RNA (rRNA) 或其他 RNA 作为内源性对照。 | |
|
标准品 |
||
| 因为数字 PCR 通过阴性与总平行样的比例确定分子绝对计数，所有无需标准品。 | 由于样品量会除以校准品的量，所以标准曲线中的单位便被去除了。因此，对于标准品来说，只需知道其相对稀释比。对于相对定量，任何含有合适目标分子的 RNA 或 DNA 储存液都可用于制备标准品。 |